Epsilon-poly-L-lysine: een nieuw middel in de strijd tegen cariës?

21 maart 2018

Heeft Epsilon-poly-L-lysine een remmend effect op de zuurproductie door de totale mondflora in speeksel? Daniek Groeneveld en Tim Vroegindeweij zochten in het kader van hun bachelorscriptie aan ACTA naar het antwoord op deze vraag.

Cariës ontstaat doordat bacteriën in tandplaque koolhydraten uit het dieet fermenteren tot melkzuur, wat leidt tot een pH-daling in tandplaque. Inname van koolhydraten leidt tot lage pH-waarden in de tandplaque, waardoor de groei van cariogene micro-organismen en het ontstaan van cariës worden bevorderd. Traditioneel wordt cariës bestreden door plaque mechanisch te verwijderen, aangevuld met therapeutische componenten, zoals fluoride.

Daarnaast zijn er middelen die de ontwikkeling of de samenstelling van de tandplaque beïnvloeden. Enerzijds zijn er bactericide componenten, zoals chloorhexidine. Anderzijds zijn er middelen die de plaque-ecologie beïnvloeden, zoals arginine. Arginine neutraliseert het gevormde melkzuur en remt op die manier de pH-daling.

In deze studie is onderzoek verricht naar epsilon-poly-L-lysine (ε-PL), een stof die potentieel zowel antimicrobieel werkzaam is en de pH-daling in tandplaque kan remmen. Basisch aminozuur ε-PL is een polymeer van het aminozuur L-lysine. L-lysine behoort, net als arginine, tot de basische aminozuren. ε-PL behoort tot de groep van antimicrobiële peptiden, die een belangrijke rol spelen in de afweer en die ook in ons speeksel voorkomen. ε-PL wordt dankzij haar brede antimicrobiële spectrum, gunstige chemische eigenschappen en smaak op grote schaal toegepast als conserveermiddel in de voedingsindustrie. ε-PL is nauwelijks toxisch voor eukaryote cellen en is door de US Food and Drug Administration geregistreerd als GRAS-component (Generally Recognized As Safe).

Eerder onderzoek heeft aangetoond dat ε-PL antimicrobieel werkt tegen enkele orale micro-organismen, waaronder Streptococcus mutans. Het doel van deze studie was om het remmende effect van ε-PL te onderzoeken op de zuurproductie door de totale mondflora in speeksel. Onderzocht werd of een remmend effect kon worden toegeschreven aan bactericide activiteit of buffering door ε-PL.

Materiaal en methode

Van 4 individuen werden speekselmonsters genomen. Bacteriën in speeksel werden door centrifugeren gescheiden van de overige speekselcomponenten en vervolgens werd van deze bacteriën een suspensie in buffer bereid. De vorming van melkzuur werd gemeten door aan deze suspensie sucrose toe te voegen. Zuurvorming werd gemeten met behulp van de zuurindicator broomcresolpurper, waarvan de kleur tussen pH 7 en 5 omslaat van paars naar geel. Het effect van ε-PL op de vitaliteit van de bacteriecellen werd bestudeerd met behulp van propidium iodide dat dode bacteriën doet fluoresceren.

Resultaten

Allereerst is het effect van ε-PL op de zuurproductie door orale micro-organismen onderzocht. Vervolgens is een aantal experimenten uitgevoerd om het werkingsmechanisme te verhelderen. 

Effect van ε-PL op de zuurvorming

Om te beginnen werden het effect van ε-PL op de zuurvorming en de invloed van verschillende ε-PL concentraties onderzocht. Daartoe werden 5 ε-PL oplossingen bereid met concentraties van respectievelijk 1 mM, 250 μM, 100 μM, 25 μM en 10 μM ε-PL. Vervolgens werd een pH microplate-assay uitgevoerd met de verschillende concentraties.

Alle concentraties gaven een significante (p < 0.05) remming van de pH-daling in vergelijking met de controle zonder ε-PL. De 25 μM ε-PL oplossing leidde na 180 minuten nog steeds tot een remming van de pH-daling, terwijl de 10 μM oplossing een sterk verlaagd remmend effect vertoonde in vergelijking met de andere 4 concentraties (Figuur 1).

Op basis hiervan werd besloten de experimenten te vervolgen met de oplossing van 25 μM ε-PL.

Opmerkelijk is dat de begin-pH van de ε-PL-bevattende monsters al hoger was dan die van de monsters met slechts water of sucrose, wat wijst op buffering door ε-PL.

Antimicrobiële activiteit van ε-PL

Om te onderzoeken of 25 μM ε-PL de zuurvorming remt door bacteriën te doden, werd een fluorescentietest met propidium iodide uitgevoerd. Speekselsuspensies werden 30 minuten geïncubeerd met 25 μM ε-PL. Een gekookte speekselsuspensie diende als positieve controle.

De resultaten van de positieve controle bepaalden de drempelwaarde tussen levende en dode cellen. De resultaten van de fluorescentietest zijn weergegeven in tabel 1.

81,8% van de gekookte bacteriën kwam boven de drempelwaarde voor fluorescentie uit. In de speekselsuspensie zonder ε-PL kwam 29,8% boven de drempelwaarde uit, terwijl in de met ε-PL geïncubeerde speekselsuspensie 52,5% van de cellen zich boven deze drempelwaarde bevond.

Hoewel de zuurvorming door 25 μM ε-PL volledig wordt geremd, blijkt dus dat slechts een gedeelte van de bacteriën wordt gedood.

Buffercapaciteit

Om te onderzoeken of de zuurremmende eigenschappen door de buffercapaciteit werden bepaald, werden oplossingen van ε-PL getitreerd. Uit de titratiecurves blijkt dat de ε-PL-oplossingen substantieel meer HCl behoeven om een pH van 4,5 te bereiken ten opzichte van de controle met water en speekselbuffer (Figuur 2).

Om te onderzoeken welke van de twee mechanismen van ε-PL – antimicrobiële activiteit of buffering – de grootste rol speelt bij het remmen van de pH-daling, werd een experiment uitgevoerd waarbij gebruik werd gemaakt van het gegeven dat buffering onmiddellijk optreedt, terwijl antimicrobiële activiteit over een langere tijd verloopt. ε-PL werd toegevoegd op verschillende tijdstippen (30, 60 en 90 minuten), waarna de pH werd vergeleken met het monster waar vanaf t = 0 ε-PL aanwezig was.

De pH-daling was significant groter dan bij het monster waaraan op t = 0 ε-PL werd toegevoegd (p = 0,048).

Deze resultaten bevestigen dat verschillende mechanismen verantwoordelijk zijn voor het remmende effect van ε-PL op de pH-daling (Figuur 3).

Discussie

Dit onderzoek toont aan dat 25 μM ε-PL de pH-daling door speekselbacteriën na het toevoegen van sucrose volledig remt. Volgens de US Food and Drug Administration is het toegestaan tot 50 ppm of ongeveer 11,7 μM ε-PL toe te voegen aan voedingsmiddelen. De in dit onderzoek gebruikte minimale concentratie van 25 μM overschrijdt dit, maar daar staat tegenover dat mondverzorgingsproducten niet worden geconsumeerd. Vervolgonderzoek dient dan ook aandacht te besteden aan het effect van deze minimale concentratie Epsiliseen® op eukaryote cellen.

De remming van de pH-daling kan volgens de resultaten van deze studie worden toegeschreven aan een synergetisch mechanisme van antimicrobiële en bufferende activiteit. Remming van de pH-daling impliceert dat ε-PL het ecologisch evenwicht in tandplaque beïnvloedt ten gunste van de gezonde microflora. Verder onderzoek moet uitwijzen of ε-PL ook in vivo een effect heeft op de plaque-ecologie en of ε-PL mogelijk preventief werkt tegen het ontstaan van cariës.

Bovendien dient de activiteit van ε-PL in een mondverzorgingsproduct verder te worden onderzocht.

Volgens dit onderzoek is ε-PL vooralsnog een veelbelovende therapeutische stof voor de preventie van cariës.

Geleidelijk en organisch

De Amsterdamse studenten Daniek Groeneveld (23) en Tim Vroegindeweij (22) wilden graag een biomedisch onderzoek doen. Bij Groeneveld was die interesse er altijd al, ze studeerde 2 jaar farmacie in Groningen voordat ze bij tandheelkunde werd ingeloot. Dat dat haar lukte, was een droom die uitkwam. De samenwerking tussen beiden verliep naar hun zeggen geleidelijk en organisch. Ze raakten goed op elkaar ingespeeld, vulden elkaar aan en wisten elkaars kwaliteiten te vinden. Beiden vonden het ontzettend leuk en leerzaam om onderzoek te doen. Tegelijk hadden ze het gevoel een beetje in het diepe te worden gegooid, al werden ze goed begeleid. “Je doet toch dingen die je in het normale curriculum niet krijgt”, aldus Groeneveld. De resultaten waren hoopvol. Vroegindeweij: “Natuurlijk hoopten we dat er iets uit kwam, maar van te voren kun je niet bedenken wat.” De 2 studenten maakten vaak lange dagen en soms bleek aan het eind van de dag dat er niets was uitgekomen. Dat vonden ze wel frustrerend. Behalve dat er keihard gewerkt is, werd er ook veel gelachen. Hoe schatten de tandartsen in spe hun winkansen in? “Dat is lastig. Maar het is een leuk onderwerp dat actueel is en goed toepasbaar in de algemene praktijk”, aldus Vroegindeweij, die naast tandheelkunde ook kunstgeschiedenis studeert, onder meer omdat hij beter wil leren schrijven. Dat is met deze scriptie wel gelukt, denkt hij.

Daniek Groeneveld en Tim Vroegindeweij, Amsterdam

Het onderzoek van Daniek Groeneveld en Tim Vroegindeweij of epsilon-poly- L-lysine een remmend effect heeft op de zuurproductie door de totale mondflora in speeksel, is één van de 5 genomineerde inzendingen voor de Nt- GSK Bachelorscriptie Award 2018.

Het onderzoek is gedaan in Amsterdam en werd begeleid door dr. Toon Ligtenberg.

PDF iconnt_artikel_figuren_31-01.pdf