Glutaminezuur en de remineralisatie van carieus weefsel

21 maart 2018

Welke invloed heeft glutaminezuur op de remineralisatie van carieus weefsel na het gebruik van diverse etsmiddelen? De Nijmeegse studenten Manon Peerlings en Cynthia Cooiman deden er in het kader van hun bachelorscriptie onderzoek naar.

Cariës ontstaat door een combinatie van leefstijl-, omgevings- en gastheerfactoren. Wanneer een cariëslaesie ontstaat, kan de laesie voortschrijden. In het beginstadium van de vorming van een laesie voldoet een preventief beleid, maar in een later stadium is operatief ingrijpen noodzakelijk. In dat geval kan worden gekozen voor het ineens geheel of gedeeltelijk verwijderen van het aangetaste weefsel of stapsgewijze verwijdering ervan (stepwise excavation). Hierna wordt een restauratie vervaardigd.

Bij diepe laesies is de kans op exponatie van de pulpa na verwijdering van de cariës groot. Om dit te voorkomen, wordt geregeld gebruik gemaakt van (in)directe pulpa overkapping en conventionele tandheelkundige materialen om remineralisatie van dentine te bewerkstelligen, zoals Mineraal Trioxide Aggregaat (MTA). Dit materiaal wordt echter vooral gebruikt bij de remineralisatie van gedemineraliseerd glazuur en het klinisch gebruik gaat gepaard met diverse nadelen, zoals hoge kosten, verkleuring van de tand en een lange uithardingstijd.

Een nieuw middel dat werkzaam is bij de remineralisatie van gedemineraliseerd dentine zou een uitkomst zijn.

Aminozuren

Onderzoek naar het effect van glutaminezuur op de remineralisatie van gedemineraliseerd glazuur liet recent positieve resultaten zien. Glutaminezuur is een stof die van nature in het menselijk lichaam voorkomt. Het is één van de 20 aminozuren uit het lichaam, maar behoort niet tot de voor ons essentiële soorten. Het lichaam is namelijk zelf in staat via verschillende routes dit aminozuur te vormen.

Ook buiten het lichaam kan glutaminezuur geproduceerd worden. Pan et al. (2007) en Matsumoto et al. (2002) hebben aangetoond dat glutaminezuur en asparaginezuur, in water opgelost, sterk reageren met calcium. Wu et al. (2015) onderzochten welk effect glutaminezuur en asparaginezuur hebben op de kristalgroei van gecarboniseerd hydroxyapatiet (CHA) op de glazuurprismata. De onderzoekers concludeerden dat CHA in combinatie met glutaminezuur of asparaginezuur, de potentie hebben vroege cariëslaesies te remineraliseren. De ontstane kristallen groeiden in bundels en waren qua morfologie en richting vergelijkbaar met natuurlijke kristallen. Het is echter nog onduidelijk wat het mineraliserend vermogen van glutaminezuur op gedemineraliseerd dentine is.

Kunstmatige laesies

Om in vitro experimenten te kunnen uitvoeren, worden in het dentine van runderelementen of geëxtraheerde humane elementen kunstmatige cariëslaesies aangebracht. Hiervoor zijn verschillende soorten gels en oplossingen ontwikkeld. Deze zorgen voor de stimulatie van een cariogene biofilm, zodat er metabole producten gevormd kunnen worden. Afhankelijk van de soort oplossing of gebruikte gel kunnen de resultaten zowel mechanisch als fysisch van elkaar verschillen. Ook verloopt het demineralisatieproces van kunstmatige cariës agressiever dan de natuurlijke ontwikkeling van cariës laesies.

Het doel van deze studie is het effect van glutaminezuur op de remineralisatie van gedemineraliseerd dentine te onderzoeken na het gebruik van verschillende etsmiddelen.

De hypotheses zijn als volgt:

  • Bij behandeling met glutaminezuur zal meer kristalgroei plaatsvinden en de remineralisatie zal sneller verlopen dan bij de groep zonder glutaminezuur-behandeling.
  • De hardheid van het gedemineraliseerde dentine neemt bij behandeling met glutaminezuur meer toe dan bij de groep zonder glutaminezuur.
     

Materiaal en methoden

Het onderzoek is in vitro uitgevoerd. Blokjes dentine werden uit intacte humane molaren gezaagd. Hiervoor werd de wortel transversaal verwijderd ter hoogte van het dak van de pulpakamer en het glazuur weggeslepen.

In totaal werden 108 dentineblokjes gedemineraliseerd met behulp van 3 typen etsmiddel:

  • 0,1 M melkzuur;
  • 10 procent ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA);
  • 37 procent fosforzuur.

Per etsmiddel werd vervolgens de helft van de blokjes behandeld met glutaminezuur (experimentele groepen). De samples die niet met glutaminezuur werden behandeld, waren de controlegroepen. De concentratie glutaminezuur werd overgenomen van recent experimenteel werk binnen het Radboudumc waaruit bleek dat een glutaminezuurconcentratie van 10 mg/ml het meest effectief was. Elk sample werd vervolgens in 10 ml simulerende lichaamsvloeistof (SBF) gelegd, dat iedere 3,5 dag werd ververst.
Na 7, 14 en 21 dagen in SBF werden uit elke groep 6 samples geanalyseerd door middel van:

  1. calciumbepaling van het supernatant; 
  2. bepaling van de Vickers hardheid en;
  3. meting van de morfologie via scanning elektronenmicroscopie (SEM) en fourier transform infrarood spectroscopie (FTIR).

De data die uit de Vickers hardheidtest en de calciumbepaling werden verkregen, zijn statistisch getest door middel van een One way Analysis of Variance (ANOVA) met Tukeytest (post hoc test) en een ongepaarde student t-test. Bij beide geldt dat sprake is van significantie bij p<0,05.

Resultaten

Figuur 1 laat de resultaten van de calcium-assay zien. De combinatie van EDTA met glutaminezuur nam het meeste calcium op gedurende de gehele tijdsperiode (p<0,0001). Ook tussen de verschillende etsmiddelen kon een significant verschil in calciumopname aangetoond worden, waarbij de groep EDTA de meeste opname liet zien, gevolgd door melkzuur en ten slotte fosforzuur (p<0,001). Alle blokjes vertoonden een vergelijkbare Vickers hardheid.

 

Figuur 2 toont een elektronenmicroscopische opname van de dentineblokjes geëtst met EDTA en vervolgens al dan niet behandeld met glutaminezuur, na een incubatieperiode in SBF van 14 en 21 dagen. Bij de met EDTA behandelde oppervlakken is op alle momenten een tubulistructuur te zien.
Bij de groep zonder glutaminezuur is na 14 dagen remineralisatie op het oppervlak ontstaan, welke na 21 dagen nog duidelijker te zien is. Ook bij de groep met glutaminezuur is een duidelijke remineralisatie ontstaan, welke de tubuli nog maar net vrij laat. De gele pijlen tonen duidelijk remineralisatie aan het dentineoppervlak.

Discussie

De samples werden gedurende respectievelijk 7, 14 en 21 dagen in SBF geïncubeerd. Glutaminezuur kan in deze tijd mogelijk uitgespoeld worden door de SBF. Omdat in dit onderzoek onduidelijkheid bestaat over de aanwezigheid van glutaminezuur tijdens de gehele tijdsperiode, kan het gebruik van een CaCO3 laag mogelijk een verbetering van hechting geven. In het onderzoek van Wu et al. (2015) is gebruik gemaakt van een dunne CaCO3 laag als ‘actieve brug’ voor het gedemineraliseerd glazuuroppervlak. De remineralisatie bij de dentineblokjes behandeld met glutaminezuur vertoonden een toename in de ordening van de gevormde hydroxyapatiet kristallen. Daarnaast nam de mate van remineralisatie bij behandeling met glutaminezuur in dit onderzoek toe.

EDTA met glutaminezuur laat de hoogste calciumopname zien. Een verklaring hiervoor kan zijn dat, doordat bij demineralisatie met EDTA voornamelijk de (positief geladen) calciumionen uit het dentine worden weggevangen, een negatieve oppervlaktelading ontstaat, welke bij incubatie in SBF al snel de positieve calciumionen aantrekt. De calciumopname is bij deze groep significant hoger bij behandeling van het dentineoppervlak met glutaminezuur. Het werkingsmechanisme van glutaminezuur is nog onbekend, waardoor een verklaring hiervoor niet met zekerheid te geven is. Meer en grootschaliger onderzoek is noodzakelijk om hier een uitspraak over te kunnen doen.

Klinisch gezien zijn de behaalde resultaten nog niet relevant en uiteraard, zoals veel in vitro onderzoek, nog niet klinisch toepasbaar. Wel zijn de resultaten veelbelovend en bieden zij perspectief voor vervolgonderzoek.

Wat de uitvoering van het onderzoek betreft zijn er nog wel kanttekeningen te plaatsen met betrekking tot de preparatie van de samples. Zo is het raadzaam de afmetingen van de samples meer met elkaar overeen te doen komen en ook het glazuur in dezelfde mate te verwijderen. Bij enkele dentineblokjes in de groepen EDTA en melkzuur werd bacteriegroei waargenomen tijdens de incubatieperiode in SBF na analyse met de SEM. Het is daarom raadzaam om bij vervolgonderzoek een antibacterieel middel toe te voegen, om groei van micro-organismen op het dentineoppervlak tegen te gaan.

Conclusie

Uit de calcium-assay blijkt dat etsen met EDTA en een vervolgbehandeling met glutaminezuur tot meer opname van calcium leidt ten opzichte van de controlegroepen. Er is geen significant verschil gevonden tussen de groepen in Vickers hardheid of remineralisatiesnelheid. Wel is tussen de etsmiddelen onderling een verschil gevonden in Vickers hardheid en laten daarnaast de SEM opnamen en infraroodspectra verschillen tussen de etsmiddelen zien.

Literatuur

  1. Matsumoto T, Okazaki M, Inoue M, Hamada Y, Taira M, Takahashi J. Crystallinity and solubility characteristics of hydroxyapatite adsorbed amino acid. Elsevier Ltd; Bioma-terials 23 (2002) 2241-2247.
  2. Pan H, Tao J, Xu X, Tang R. Adsorption processes of Gly and Glu amino acids on hydroxyapatite surfaces at the atomic level. Langmuir, 2007 Aug 14;23(17):8972-81.
  3. Wu X, Zhao X, Li Y, Yang T, Wang K. In situ synthesis carbonated hydroxyapatite layers on enamel slices with acidic amino acids by a novel two-step method. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2015 Sep; 54:150-7.

Geen taakverdeling nodig

Vanaf het eerste jaar van hun studie tandheelkunde zijn de Nijmeegse studenten Manon Peerlings (22) en Cynthia Cooiman (22) al vriendinnen en trekken ze samen op in hun studie. Het was dan ook vanzelfsprekend dat ze samen hun bacheloronderzoek en –scriptie zouden gaan uitvoeren. Van te voren hadden ze niet echt een taakverdeling afgesproken. Dat was ook niet nodig, want de samenwerking verliep als vanzelf. “We vulden elkaar aan bij de stappen die we moesten zetten”, aldus Peerlings.

In het onderzoek namen ze de relatie tussen glutaminezuur en dentine onder de loep. Hier kwam het nodige laboratoriumwerk bij kijken, iets dat in het begin vrij lastig was omdat ze de weg in het laboratorium niet kenden. “Maar dr. Joop Wolke, onze scriptiebegeleider heeft ons er goed bij geholpen.”

Uiteindelijk vonden beiden het praktische laboratoriumwerk het leukste aspect van hun onderzoek. Het schrijven van de scriptie was het lastigste onderdeel. “Vooral de discussieparagraaf”, zegt Cooiman. “Maar daar zijn we goed uitgekomen”.

De nominatie voor de NT-GSK Bachelorscriptie Award kwam niet helemaal onverwacht: ze kregen in hun jaar het hoogste cijfer voor hun scriptie. Hoewel de twee met plezier op de onderzoeksperiode terugkijken, ambiëren ze geen onderzoekscarrière. Liever gaan ze als algemeen practicus aan de slag. Wel zien ze voor zich dat ze na hun afstuderen vanuit de praktijk aan onderzoek meewerken.

Manon Peerlings en Cynthia Cooiman, Nijmegen

Het onderzoek van Manon Peerlings en Cynthia Cooiman naar de invloed van glutaminezuur op de remineralisatie van carieus weefsel na het gebruik van diverse etsmiddelen is één van de 5 genomineerde inzendingen voor de Nt- GSK Bachelorscriptie Award 2018. Het onderzoek is gedaan in Nijmegen en werd begeleid door dr. Joop Wolke.

0 reacties op Glutaminezuur en de remineralisatie van carieus weefsel