Filters

Retinolzuur en de mineralisatie van pre-osteoblasten

De Nijmeegse studenten Isabelle Gersie en Rik Teunissen deden voor hun bachelorscriptie onderzoek naar het effect van retinolzuur op de mineralisatie van de pre-osteoblasten. Dit was één van de vijf genomineerde scripties die meedong naar de NT-GSK Bachelorscriptie Award 2020.

Tekst: Isabelle Gersie en Rik Teunissen

 

Vitamine A speelt een belangrijke rol in de botvorming tijdens de embryonale ontwikkeling. In deze fase kunnen veel processen, zoals de vorming van het palatum, worden verstoord door een tekort of overschot aan vitamine A met craniofaciale afwijkingen tot gevolg. Er is veel bekend over de teratogene werking van vitamine A op de ontwikkeling van zachte weefsels, maar over de effecten op de botvorming is weinig bekend. Het doel van deze studie is het onderzoeken van de effecten van vitamine A op de proliferatie, de mineralisatie en de alkalische fosfatase activiteit van MC-3T3 cellen. 

Materiaal en methode

MC-3T3 cellen zijn stamcellen van het schedeldak van muizen-embryo’s. In dit experiment worden MC-3T3 cellen gebruikt omdat ze vergelijkbaar zijn met menselijke pre-osteoblasten. De cellen worden in vitro gekweekt en kunnen differentiëren tot osteoblasten die een gemineraliseerde matrix vormen.
In dit onderzoek wordt gewerkt met de geoxideerde vorm van vitamine A: retinolzuur (RA). RA is een apolaire stof die daarom wordt opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO). DMSO kan in te hoge concentratie een toxisch effect hebben op de cellen. Er wordt daarom rekening gehouden met de concentratie DMSO en is er een extra controlegroep om de effecten van DMSO te kunnen controleren.

Figuur 1.0

Het onderzoek bestaat uit een 8 dagen durend pilot-experiment gevolgd door een 25 dagen durend hoofdexperiment. Een hoge dosis vitamine A remt de proliferatie van MC-3T3 cellen en kan ervoor zorgen dat de cellen ongewenst sterven. Om twee geschikte concentraties voor het hoofdexperiment te bepalen, worden MC-3T3 cellen gedurende het pilot-experiment gekweekt met vier verschillende concentraties RA. Daarnaast zijn er twee controlegroepen, één met DMSO en één zonder. De proliferatie wordt op verschillende tijdstippen bepaald met behulp van een DNA-assay. Gedurende het hoofdexperiment wordt de mineralisatie van de MC-3T3 cellen beoordeeld door middel van een Alizarine rood kleuring. Daarnaast wordt de ALP-activiteit bepaald met een ALP-assay. 

Resultaten

Het pilotexperiment (figuur 1*) laat zien dat de celproliferatie van MC-3T3 cellen met RA (groep A t/m D) wordt geremd en dat deze groepen allen significant afwijken van de controlegroepen. Tussen de groepen met RA is er geen significant verschil gevonden, er is daarom een arbitraire keuze gemaakt voor twee RA-concentraties die gebruikt worden in het hoofdexperiment.

Figuur 2.0
In het hoofdexperiment worden MC-3T3 cellen gedurende 21 dagen gekweekt in differentiatie medium met twee verschillende concentraties RA (groep A: 0.2 μM RA en groep B: 0.04 μM RA) en twee controlegroepen met en zonder DMSO (respectievelijk groep C en D). Op dag 7, 14 en 21 wordt de ALP-activiteit gemeten (figuur 2*). Groep A heeft een significant hogere ALP-activiteit dan de controlegroepen. Onderling verschillen de groepen B, C en D niet significant van elkaar. 
Om de mineralisatie te meten worden dezelfde groepen A t/m D gedurende 25 dagen in differentiatie medium gekweekt. Op dag 7, 14, 21 en 25 is een Alizarine rood kleuring gedaan en zijn alle wells gefotografeerd (figuur 3a*). Met behulp van Image J (NIH) zijn de foto’s van de wells geanalyseerd en is het gemineraliseerde oppervlaktepercentage berekend (figuur 3b*). Op dag 21 wijkt het oppervlaktepercentage van controlegroep C significant af van controlegroep D. Vanaf dag 21 is er in controlegroep D explosieve groei te zien van het gemineraliseerde oppervlak. Het oppervlaktepercentage van groep A, B en C wijkt op dag 25 significant af van controlegroep D.

Discussie

De resultaten van het pilotexperiment laten zien dat het toedienen van RA een negatief effect heeft op de proliferatie van de MC-3T3 cellen. Dit komt overeen met de resultaten van Guo et al. (2008) en Ackermans et al. (2011).
Tijdens het alkalische fosfatase assay experiment vertoonde de groep MC-3T3 cellen met de hoogste concentratie RA ook de hoogste alkalische fosfatase activiteit. RA kan een stimulerend effect hebben op de alkalische fosfatase activiteit en dit effect is dosisafhankelijk (Zhang et al., 2010; Bi et al., 2013; Liu et al., 2014; Shao et al., 2016).

Figuur 3a
Figuur 3b

Uit het hoofdexperiment blijkt dat RA een significant remmend effect heeft op de mineralisatie door MC-3T3 cellen. Vergelijkbaar effect is in eerder uitgevoerde onderzoeken aangetoond. Een hogere dosis RA, getest op menselijke pre-osteoblasten en MC-3T3 cellen, resulteerde in remming van de mineralisatie (Chen et al., 2010; Lind et al., 2013). Een verklaring voor deze remming is dat RA via verschillende processen de collageensynthese, een belangrijk proces voor de botvorming, onderdrukt (Roforth et al., 2012).

Het is opvallend dat de mineralisatie door MC-3T3 cellen wordt geremd door RA, ondanks dat de ALP-activiteit van de cellen omhooggaat. Remming van de mineralisatie wordt verklaard doordat de hoeveelheid collageen indirect sterk wordt verminderd door RA. Aangezien de mineralisatie een belangrijk onderdeel is van de botvorming, zal de botvorming ernstig verstoord worden door de remmende effecten van RA. 
Niet alleen RA heeft een significant remmend effect op de mineralisatie door MC-3T3 cellen, ook DMSO heeft in de controlegroep een significant remmend effect. Roa et al. 2019 onderzochten het effect van verschillende concentraties DMSO op de osteogene differentiatie van stamcellen afkomstig uit de gingiva. Hieruit bleek dat kweken met concentraties DMSO variërend van 0.01% tot 3% significant minder calcium afzetting vertoonden vanaf dag 21. Dit komt overeen met de in het hoofdexperiment gevonden resultaten.

Conclusie

Uit de gevonden resultaten kan geconcludeerd worden dat RA een remmende werking heeft op zowel de proliferatie als de mineralisatie van MC-3T3 cellen. Daarnaast kan geconcludeerd worden dat RA zorgt voor een toename van de alkalische fosfatase activiteit van MC-3T3 cellen. RA heeft een verstorend effect op de botvorming tijdens de embryonale ontwikkeling met mogelijk craniofaciale afwijkingen tot gevolg. Nader onderzoek is nodig om de exacte werking van RA te bepalen. Met in vivo onderzoek kan worden bepaald bij welke dosis RA negatieve effecten optreden op de botvorming en welke drempelwaarde hierbij hoort. Deze drempelwaarde kan van groot belang zijn om de juiste voedingsadviezen te kunnen geven aan zwangere vrouwen. Op het moment dat de effecten van RA op de embryonale botvorming volledig in kaart zijn gebracht, kunnen craniofaciale afwijkingen zoals schisis in de toekomst wellicht voorkomen worden. 

Lees alle genomineerde scripties 2020

Total votes: 69